"Зарубленная" диссертация
Тему искать не пришлось. Все его детство было связано с хреном. Таблеток у деревенских бабушек не было. Здоровье поправляли дарами природы. И как только стаивал снег, шли в огород копать целебный корень. Написал и сам же свою диссертацию "зарубил".
Я подумал, что сметану слизал, не раскрыв сути. За агротехникой упустил что-то главное, - объясняет ученый свой неординарный поступок.
В погоне за истиной он рассуждал примерно так. На родине хрена, в России, в течение 60 лет его практически списали со счетов. Из 500 существовавших сортов осталось всего 2-3. А в Европе, где он появился 200 лет назад, сегодня 2,5 тысячи сортов. В Америке, куда его завезли в 1900 году по инициативе министерства сельского хозяйства, уже 3,5 тысячи. И работа над его разведением продолжается. Зачем?
Первая полузакрытая информация о том, что с помощью препарата из хрена можно излечивать рак, просочилась из Израиля. Позднее "засветились" Америка и Европа. Я обратился к ученым из ящурного института и института микробиологии. Они расшифровали формулу препарата - пероксидаза. Из тонны протертого хрена его получали всего полграмма. Стал приставать, как бы его "пощупать" и посмотреть, - рассказывает Емелин.
Впору было подключать к делу разведчиков. Так и случилось. С их помощью вышли на одну французскую фирму, которая торговала нашей нефтью. Нажали. Те пообещали поставить завод по выпуску пероксидазы. Но технология ее получения оставалась под замком.
Прямо с поля, чтобы не успело улетучиться самое ценное, совхозный хрен отправили на анализ в лабораторию во Францию. Анализ затерялся. Отправили во второй раз.
И оказалось, что в нашем хрене содержание пероксидазы в 50 раз выше, чем в импортном. То есть из одной тонны мы можем получить не 0,5 грамма, а 25 граммов. "Вы хоть 30 тысяч сортов хрена выведете, а такого, как у нас в России, никогда не получите. Это наше достояние", - торжествовал тогда Емелин.
Оказалось, что в нашем хрене содержание пероксидазы в 50 раз выше, чем в импортном.
А защита его диссертации о хрене все-таки состоялась. Научным руководителем была ученица Ивана Владимировича Мичурина профессор сельхозинститута в Балашихе Марина Владимировна Алексеева. Оппонентами - корифеи овощеводства, с трудом верившие, что какой-то колхозник из владимирской глубинки замахнулся на такую тему. Итогом защиты стало методическое пособие по промышленному выращиванию хрена. Тем временем ученые двух владимирских институтов, ящурного и вирусологии, которым Емелин поставлял сырье из своего хозяйства, создали технологию получения отечественной пероксидазы.
Мы стояли на пороге промышленного получения вещества, цена которого на мировом рынке доходила до 7 тысяч долларов за грамм. Если 100 лет назад суздальцы очень выгодно торговали с Германией, отправляя туда по 40 вагонов корней хрена в год, то эта технология могла стать для страны золотым дном, - убежден Юрий Анатольевич.
Но началась перестройка, и стране было не до хрена. Научные исследования свернули, а масштабы его промышленного выращивания сократились до одного поля в совхозе "Ставровский", директором которого к тому времени стал Емелин.
Огородный Змей Горыныч
А может, и хорошо, что ограничились одним полем? - думаю я вслух, вспоминая, как трудно с ним бороться. Стоит завестись хрену в огороде, ни за что не выведешь. На ум приходит рассказ известного артиста, а теперь и губернатора Михаила Евдокимова о том, как пытался избавиться от хрена, но не помог даже тол.
Что же тогда делать?
А не надо с ним бороться. Его можно только приручить. Хрен прекрасно уживается с луком, картошкой и другими огородными культурами и защищает их от вредителей. Это давно подметили наши предки. Еще 500 лет назад они говорили: огород без хрена, как стадо без пастуха. А когда заводили огороды, в первую очередь определяли место, где будет расти хрен.
Не случайно на суздальской земле были хрено-луковые плантации. Сначала убирали лук, а следом за ним хрен. То же и с картофелем. В сентябре его выкопали, а в октябре подошел хрен. Мы сеяли по хрену пшеницу, рожь. И получали по 50-60 центнеров с гектара, - рассказывает Емелин.
Изучая хрен, Емелин дошел до "археологических" раскопок. На участке, где тот рос, просеивал землю и подсчитывал корешки. И сделал вывод, что существует хрен двух видов. Уходящий корнями на глубину до 15 метров он назвал материнским. Образовавшийся в верхнем слое почвы из маленьких корешков, оставшихся после уборки, - верховым.
Истинный хрен - материнский. Он достает с подпочвенных слоев, так называемой адамовой земли, те питательные вещества и элементы, которых здесь уже нет. Но и верховой хрен-сорняк может стать материнским. Дай время, ведь за год он уходит в землю на 60-70 см.
Значит, "заражение" хреном вполне вероятно? - высказываю опасение Емелину. А он в ответ предъявляет новый аргумент:
Хрен - культура саморегулируемая. Как в одну пустую бочку не нальешь две бочки воды, так и на одном участке земли не вырастет его больше, чем положено.
А сколько положено?
Его урожайность - максимум 4-5 тонн корней с гектара. Такое резкое ограничение рамками урожайности отличает хрен от других культур. Это я говорю с полной ответственностью как человек, посвятивший его изучению более 30 лет. Но уж если он поселился, то на века. На земле, где выращивают хрен, он родится по 100 и даже по 300 лет.
Значит, прав Михаил Евдокимов и спасет от него только ядерная бомба? - продолжаю спор от лица всех огородников.
Вы же не будете после того, как собрали яблоки, пилить яблоню? Она даст урожай и на следующий год. Так и с хреном. Раньше его копали в том месяце, в названии которого есть буква "р": сентябрь, октябрь, ноябрь (в остальное время в нем нет той остроты и горчичного запаха)... Срежете, на сколько можете, верхушку, а к следующему сезону на этом месте нарастет еще больше.
Когда на Руси говорили о Змее Горыныче, у которого на месте одной срезанной головы отрастают три, то наверняка имели в виду хрен, - поясняет Емелин.
Зри в корень
СПК "Ставровский" - одно из редких мест в России, где можно увидеть поле цветущего хрена. И говорят, пчелы над ним летают сутками. Правда, хренового меда директору есть не приходилось. А вот цветы дарил. Они, считает Емелин, красоты необыкновенной.
И семена у хрена образуются. Но если их посеять, ничего не взойдет. Хрен размножается только с помощью корней - вегетативно. Почему? Ответа Емелин не нашел. Но зато это один из моментов, позволяющий ученому думать о его древнейшем происхождении. Пережив сильнейшие катаклизмы, растение, видимо, таким образом приспособилось и выжило.
До сих пор нет точного ответа: овощ он, лекарственное растение или пряность? Отсутствие четких видовых границ тоже, по мнению Емелина, подтверждение гипотезы, что хрен - посланец Атлантиды.
Происхождение многих культур давно известно. Откуда же появился хрен, в науке большая путаница. Во многих источниках я читал, что при Тутанхамоне египтяне где-то брали корень на вес золота у варваров. Но твердого убеждения, что это именно хрен, у меня нет, - не скрывает Емелин.
Но, обожествляя предмет своих исследований, он остается практиком. Объехав в поисках селекционного материала около 250 огородов Владимирской и Ярославской областей, вывел новый сорт хрена - "Толпуховский" (по названию центральной усадьбы своего хозяйства) и посадил его плантацию на крутом берегу реки Колокши. Говорит: до следующей цивилизации.
Сам Емелин употребляет хрен как лекарство. Но в отличие от нас, необразованных, учитывает, что полезные свойства в протертом хрене сохраняются только 7 дней.
В хрене, который месяцами "болтается" на магазинных прилавках, да и в наших кладовках, нет ни хрена! - говорит ученый.
Что же делать?
Выкопали из земли осенью килограммов 5-6, положили в погреб, присыпали землей, и пусть себе лежит. Доставайте оттуда понемногу, чтобы хватило на 250-граммовую баночку. Его два раза в году можно брать: зимой и ранней весной. Зимой - из погреба. А весной, чуть земля оттаяла, можно смело выкапывать до тех пор, пока листочки не отрастут до 5 сантиметров. Так делали наши предки, которые на Пасху ели поросенка со свежим хреном.
Емелину можно верить. Недавно он одну за другой выпустил три книги: "Хрен в вашем огороде", "Хрен ваш доктор" и "Хрен на вашем столе". Теперь готовит к изданию "Хренолечебник". И продолжает опровергать стереотип, что хреново - это значит плохо.
А может, действительно, когда у нас говорят, что жизнь совсем хреновая, имеют в виду только судьбу русского хрена?
" Сушествует ряд локализаций рака, которые практически не лечатся. Например, когда
метастазы проникают в печень, и в таких случаях даже химиотерапия не помогает. И только в редких случаях метастазы удается удалить хирургическим путем. Но мы знали, что пероксидаза хрена повышает иммунитет организма, а это главное условие при лечении. Эту самую пероксидазу даже научились получать в чистом виде. Но это оказалось, безумной затеей - из тонны сырья выходило 5 граммов! Когда-то я вычитал в трехтомнике «Иммунология», изданном в СССР еше в 1974 году, что попадание пероксидазы хрена в кровь увеличивает эффективность лечения в 4 тысячи раз! Но только через много лет додумался, как его ввести, - через клизму!
Вот как это делается
Натереть хрен на самой мелкой терке. Взять 1 ст. ложку хрена и залить половиной стакана кипяченой воды. Оставить в холодильнике на 12 часов. Взять детскую клизму и после стула ввести граммов 30-40. Но вначале сделать очистительную клизму.
Таким образом настойка всасывается мгновенно и сразу попадает в печень. На поверхности лейкоцитов у онкологических больных есть рецепторы, воспринимаюшие пероксидазу хрена, и вот тогда активация лейкоцитов-киллеров увеличивается в четыре тысячи раз.
Через 10-15 процедур на контрольном сканировании метастазы рака не фиксировались или купировались. Клизму с хреном делать через день.
Сложнее лечение рака легких с помошью пероксидазы хрена. Самый лучший способ - ингаляция, но она будет эффективна, если хрен измельчить до 3-5 микрон, все, что крупнее, организмом не усваивается.
В институте биоприборостроения разработаны особые ингаляторы-спинхиллеры, способные измельчить хрен и подготовить сотню ингаляций. Разработан, но не выпускается, поскольку в этом случае хрен становится лекарственным препаратом! А это семь лет испытаний, годы утверждений и т.д.
Но дышать фармкомитет не запрещает, трите и дышите, уже в самом процессе натирания вы достаточно надышитесь, а потом, накрывшись полотенцем, подышите над изготовленным лекарственным продуктом. Процедура займет 2-3 минуты. А спинхиллеров, может, и я дождусь - мне ведь всего 72!
Итак, вы натираете корни хрена и дышите 1-2 минуты, пока из глаз не потекут слезы. Делать это следует ежедневно, до полного выздоровления.
Как-то нам в редакцию позвонила читательница, страдавшая хронической пневмонией. Ей 58 лет, вылечилась таким способом менее чем за месяц.
"- Леонид Николаевич Ж. из ФРГ, у него метастазы в печени. А этот орган практически не лечится, однако опыты с микроклизмами из хрена показывали положительные результаты. Леонид Николаевич пробовал, но ощутил сильное жжение и не может жидкость достаточно долго удерживать. Что ему можно посоветовать?
- Очевидно, человек сделал слишком сильную концентрацию. При том, что клизма не должна превышать 30 граммов - ее не нужно удерживать, а жидкость сама там останется. Перед процедурой, если у вас не было стула, следует сделать очистительную клизму. Всего следует провести 10- 15 сеансов через день, а по завершении показаться врачу...
Вот звонок из Германии, из города Эссена. У Леонида Журавского (я о нем уже упоминал, когда мы писали о клизмах с настоем хрена, были у него некоторые проблемы с их применением) тяжелое заболевание, печень уже поражена метастазами. Понятно, в таких случаях говоришь предельно осторожно, ведь можно ожидать чего угодно. И вдруг слышу: «Рост метастазов остановился, будете говорить или увидите доктора Ласкина, передайте ему мою искреннюю благодарность. А вам спасибо за ваши публикации».
X
....«Я вернулась из отпуска и узнала, что Нине отказали в лечении. Нашла журналы «ФиС» со статьями доктора Ласкина, и мы начали применять его методы лечения настойками хрена и гречкой. Проблема заключалась в том, что Нина уже практически ничего не ела и не могла даже пить. Ее мучили постоянные тошнота и рвота, даже после приема воды. Первая клизмочка из хрена вызвала жжение, а последующие были безболезненны, всего сделали уже 10 процедур. Нина начала понемногу есть и гречневую кашу с добавлением небольшого количества оливкового масла. Вчера она выпила два сырых яйца. Первое яйцо (это было в обед) организм принял нормально, и Нина сказала: «Мне так стало хорошо!»,....
Обращаюсь к вам за помощью. Мы хотели бы получить консультацию доктора Ласкина и других специалистов, причем в кратчайшие сроки, так как счет идет не на месяцы, каждый день дорог.
Можно ли делать клизмочки с хреном более 15 раз?
....Мы связались с соавтором диеты Александром Балюрой. Кстати, он сейчас вплотную занят тем, чтобы упростить использование целебных свойств хрена, а точнее - пероксидазы, в нем содержащейся, она активирует макрофаги, разрушающие раковые клетки. Так вот, Балюра экспериментирует с заточением хрена в запаянную пробирку, где сохранится и жидкость, и дух, если можно так выразиться. Ведь в таких мегаполисах, как Москва, к примеру, найти корень хрена - проблема, если нет за городом участка, а если и есть, то он там редко у кого произрастает, а бабулек, торговавших у метро, городские власти давно ликвидировали.
Вот что говорит А. Балюра: «В такой тяжелой ситуации, как с подругой автора письма, можно продолжать делать клизмы из настойки хрена и дальше. Можно уменьшить количество жидкости до 5 мл (это всего-навсего столовая ложка раствора). При условии грамотной подготовки: мелкая терка, разведение холодной кипяченой водой, отстаивание в холодильнике в течение 10-12 часов».
X
Но вот женщина из Донецкой области беспокоится о своем отце. Они живут в разных городах Украины, и дочь дает советы отцу и его семье, видимо, по телефону. У отца поражены желудок и печень, но после питания гречкой и микроклизм из настоянного хрена печень уменьшилась до нормального размера. Но оказалось, что процесс переместился еще и в легкое, и теперь он регулярно дышит парами натертого хрена.
X
Несколько вопросов «технологического характера». Читатель М. из Тулы спрашивает, почему хрен для введения через клизму надо настаивать и держать в холодильнике 12 часов? Есть ли минимум и максимум? Объясняем: 10-12 часов - это время доказано лабораторным путем. Натереть нужно всего 1 ст. ложку хрена, но не делать впрок, каждый раз он должен быть свежего изготовления.
Один из читателей сетует, что после 12 часов настойка становится слишком холодной, и спрашивает, нельзя ли ее разбавить теплой водичкой? Отвечаем: нельзя, какая же это будет концентрация? Просто подержите после холодильника настойку некоторое время при комнатной температуре, и она станет приемлемой для применения.
Еще о хрене. Пока известно, что он хорошо влияет на печень, даже когда она поражена метастазами. В других случаях Ласкин использовать клизмы не рекомендует.
А вот дышать натираемым хреном можно и нужно при заболевании не только легких, но и бронхов, горла, носа, то есть всей области носоглотки. Для этого достаточно проводить процедуру два раза в день по 2-3 минуты, пока из глаз не потекут слезы. Напомню, что таким способом можно ликвидировать и менее тяжелые недуги - грипп, простуду, насморк."
Отвечая на первое письмо, могу сказать следующее. Клизмы из хрена - это, как показала практика, самый эффективный способ проникновения целебных веществ в печень, чтобы справиться с метастазами. Делать клизмы надо следующим образом: 1 ст. ложку натертого хрена залить 0,5 стакана охлажденной кипяченой воды, и все это поставить на 8-12 часов в холодильник (но не в морозилку). Затем настой процедить и приблизительно 20 мл набрать в клизму (маленькую, детскую) для введения в организм. Кашицу хрена ни в коем случае нельзя вводить в прямую кишку, так как она слишком концентрированная, и это может привести к ожогу слизистой.
Остаток процеженного настоя можно хранить еще одни сутки в холодильнике, чтобы на следующий день из него сделать еще одну клизму. Вводить такие клизмы следует после опорожнения кишечника. Делать клизмы можно ежедневно, но через день готовить новый настой из хрена, чтобы в полной мере воспользоваться его антираковыми свойствами.
Надеюсь, что мои ответы помогут авторам писем справиться с болезнью. Нас очень волнуют результаты лечения. В любом случае напишите о них в редкцию.
С пожеланиями выздоровления,
Александр БАЛЮРА, кандидат медицинских наук
Свёклу 1 кг на 5 литров воды кипятить 5-6 часов на тихом огне, получится густой отвар, растворяет камни ж/п способ проверил на себе удачи.
В № 8 «АиФ-Здоровье» за 2008 год я прочитала, что, по данным Канадской ассоциации врачей и Международного агентства по изучению рака, мощные противораковые вещества содержат многие растительные продукты. Это капуста (кочанная, цветная, брокколи, брюссельская), чеснок, лук (репчатый и шалот), шпинат, кресс-салат, семена льна, льняное масло, помидоры, черный перец, куркума, черника, малина, ежевика, голубика, клюква, виноград, темный шоколад, цитрусовые, зеленый чай, красное вино). Ежедневный прием этих продуктов может защитить от рака даже в случае плохой наследственности. В связи с этим у меня два вопроса. Если все так просто, то почему во всех странах люди не едят ежедневно эти продукты, чтобы защитить себя от рака? Почему в этот список не включены гречневая каша и оливковое масло, составляющие основу антираковой диеты доктора Ласкина?
Марина Л., Москва
Не только гречка
Диетологический метод профилактики и терапии рака в последние годы быстро развивается. Ряд специалистов, работающих в рамках этого направления, даже считают рак «болезнью недостаточности», то есть болезнью, возникающей от недостаточного потребления особых фитохимикатов, входящих в состав зеленого чая, красного вина, бурого риса, ягод, фруктов, овощей, грибов, орехов, семян, специй. Организм человека тысячелетиями адаптировался именно к такому питанию, и переход в XX веке к питанию рафинированными углеводами (белый хлеб, белый сахар, сладости, кондитерские изделия) трагически сказался на его здоровье. Одной из главных болезней цивилизации стал рак. Возвращение к рациону питания, основанному на натуральных продуктах, позволяет организму человека эффективно противостоять онкологическим заболеваниям.
В последнее время разработан целый ряд антираковых диет. В западных странах особое внимание, если говорить о продуктах, уделяется клюкве, а о диетах - средиземноморской (овощи, фрукты, продукты из цельного зерна, морская рыба, оливковое масло, сухое красное вино).
Так, недавно в США было проведено исследование действия средиземноморской диеты на способность тормозить развитие рака у 23 пациентов 43-74 лет, отказавшихся от радикального лечения, с подтвержденным на биопсии ограниченным раком простаты. В среднем через 38,5 месяца наблюдения у 87% мужчин отметили 58-процентное снижение уровня ПСА (простат специфического антигена), который был маркером активности рака. А у 3 мужчин, участвующих в этом исследовании, отмечено очень небольшое увеличение ПСА. Эти результаты свидетельствуют о значительной эффективности средиземноморской диеты в снижении прогрессии рака простаты.
Итак, сочетание в питании ряда натуральных продуктов позволяет организму контролировать, предупреждать и даже останавливать раковый процесс. Почему же люди регулярно едят не эти удивительно полезные продукты, а предпочитают вредные для здоровья сладости, выпечку и пр.? Да потому, что они гораздо вкуснее и к тому же, как алкоголь, вызывают к себе пристрастие. Это самая настоящая пищевая зависимость, и она сродни наркотической. Когда там еще рак возникнет, а разная вкуснятина прямо сейчас улучшит настроение, снимет стресс и депрессию, вернет душевное спокойствие. Попробуй, откажись! Пока гром не грянет, мужик не перекрестится. Так и живем, так и болеем, так и умираем гораздо раньше положенного срока.
Теперь по поводу второго вопроса: почему в список антираковых продуктов не включены гречневая каша и оливковое масло? Дело в том, что гречневую кашу широко употребляют в основном в России, Украине, Белоруссии. В США, Канаде, Западной Европе ее едят преимущественно эмигранты, а гречку там выращивают не для еды, а для того, чтобы извлекать из нее витамины, минералы и различные витаминоподобные вещества, в том числе кверцетин.
Читатели «ФиС» знают, что антираковые свойства гречневой каши впервые начал применять наш соотечественник доктор-онколог В.А. Ласкин. Было это более 35 лет назад. Причем особенно мощно свое действие гречневая каша стала проявлять в составе строгой диеты (гречневая каша, оливковое масло, шиповник, вода). Результаты ее применения, полученные Ласкиным, не оставляли в этом сомнений. Жена Вульфа Ласкина, тоже врач по профессии, вспоминала: «Возвращаясь вечером домой после приема, на котором был ранее больной раком, а теперь уже полностью выздоровевший (ведь многие приносили заключение онкологического учреждения, что у них нет больше онкологического заболевания), муж не мог успокоиться целый вечер и до глубокой ночи сидел над книгами, пытаясь понять, почему так мощно работает гречневая диета». Понимание пришло только в 2000 году, когда американские ученые определили, что гречневая крупа содержит 8% кверцетина, одного из самых мощных натуральных веществ для профилактики и терапии рака.
Что же касается оливкового масла, то, с моей точки зрения, доктор Ласкин несколько недооценивал роль оливкового масла в своей диете. Когда я его спросил, почему он выбрал именно оливковое масло, он ответил, что жители средиземноморского бассейна употребляют в пищу довольно много оливкового масла и мало болеют раком. Эта мысль его увлекла, но, поскольку он не знал, какие компоненты оливкового масла ответственны за антираковые эффекты, он, согласно логике советского врача, больше думал о гречневой каше с рекордным содержанием кверцетина.
А между тем в последние годы именно в оливковом масле были открыты уникальные антиоксиданты фенольной и нефенольной природы, которые не менее кверцетина важны для противодействия раку. И теперь я уверен, что эффективность диеты Ласкина связана именно с сочетанием гречневой каши и большого количества оливкового масла (6-8 ст. ложек в день).
Теперь о полезных антираковых растительных продуктах, список которых опубликован в «АиФ-Здоровье». Почти все они входят в состав «недельной диеты» доктора Ласкина. То есть сначала в течение 5-6 недель (иногда дольше) пациент соблюдает строгую диету, а затем переходит на недельную, в которую помимо гречневой каши, оливкового масла и шиповника включены черника, брокколи, грибы шитаки... Из списка продуктов, перечисленных в «АиФ-Здоровье», я бы добавил в меню Ласкина еще и клюкву, куркуму и семя льна.
Зиновий БЕЛКИН, кандидат медицинских наук
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства пероксидазы высокого качества из корней хрена для диагностических целей. Измельченную биомассу корней хрена выдерживают в 0.1 М буферном растворе фосфата натрия рН 7.0, предварительно продутом азотом, в присутствии 5 мкМ раствора гемина и 5 мМ хлористого кальция. Экстракт отделяют декантацией с последующей фильтрацией и концентрированием ультрафильтрацией через ультрафильтры с размером пор менее 30 кДа. Экстракт фермента насыщают сульфатом аммония до 35% от насыщения и наносят на колонку с фенилсефарозой, после интенсивного промывания буфера с сульфатом активные фракции снимают градиентом сульфата аммония (35%-0%) и увеличением рН до 8.0. Фермент очищают гель-фильтрацией на Toyopearl HW55F, подвергают диализу и высушивают лиофилизацией. Использование геминсодержащих буферов на стадии экстракции и гель-фильтрации позволяет получать высокоактивный фермент с высоким выходом за счет 100% насыщения фермента гемином. Это позволяет ускорить процесс производства фермента и существенно улучшить его каталитические характеристики и стабильность. 6 з.п. ф-лы, 1 табл.
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства пероксидазы высокого качества из корней хрена, предназначенной для диагностических целей.
Известен (Paul K.G. The Enzymes. New Jork, Acad. Press, 1963) способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента водой или солевым раствором и фракционирование экстракта, причем фракционирование осуществляют последовательной обработкой экстракта сульфатом аммония, гель-фильтрацией, спиртовым осаждением, электрофорезом, переосаждением хлоридом аммония, фильтрацией через Сефадекс G 50 и ДЕАЕ-целлюлозу и диализом.
Основными недостатками данного способа являются невысокая чистота и активность полученного препарата, а также сложность и продолжительность процесса его получения. Кроме того, данный способ не предполагает безотходного производства.
Известен также (HU, патент №172872) способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента водой, фракционирование экстракта сульфатом аммония и его гельфильтрацию.
Недостаток данного способа состоит в недостаточно высоком выходе фермента.
Известен (BG, патент 46675) способ получения фермента из отходов производства, включающий гомогенизацию, экстракцию фермента водой, осаждение экстракта сульфатом аммония, очистку и концентрирование фермента ультрафильтрацией и гель-фильтрацией и последующую лиофилизацию.
Известен также (RU, патент №2130070) способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию растительной ткани хрена, экстракцию фермента, отделение экстракта с проведением осаждения фермента сульфатом аммония, очистку фермента концентрированием ультрафильтрацией и гельфильтрацией, последующую лиофилизацию целевого продукта, причем в качестве растительной ткани хрена используют отходы от зачистки корней при производстве пищевой продукции, перед ультрафильтрацией в экстракт вносят сульфит натрия в эффективном количестве, осаждают фермент сульфатом аммония из ультрафильтрата, а после гель-фильтрации фермент дополнительно очищают ионообменной хроматографией.
Известный способ выбран в качестве ближайшего аналога разработанного изобретения.
Недостатками указанных способов является длительность процесса очистки с потерей активности, что приводит к ухудшению качества, а именно удельной активности, конечного продукта.
Техническая задача, на решение которой направлено разработанное техническое решение, состоит в разработке способа получения пероксидазы, обеспечивающего максимальный выход активного препарата и его высокую удельную активность.
Технический результат, получаемый при реализации разработанного способа, состоит в уменьшении расхода корней хрена и повышении выхода пероксидазы с высокой степенью чистоты и активности, а также в ускорении способа.
Для достижения указанного технического результата предложено использовать способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию растительной ткани корня хрена, экстракцию фермента, отделение экстракта, очистку фермента гидрофобной хроматографией, концентрированием ультрафильтрацией и гель-фильтрацией, последующую лиофилизацию целевого продукта, причем в экстракт вносят гемин и хлорид кальция, экстракт насыщают азотом путем продувки, а фермент очищают гидрофобной хроматографией.
В некоторых вариантах реализации способа экстракцию фермента производят в 0,1 М буферном растворе фосфата натрия или калия в течение 1 ч при продолжающейся продувке азотом.
Предпочтительно гемин вносят в экстракт до концентрации 5 мкМ, а хлорид кальция вносят в экстракт до концентрации 5 мМ.
В некоторых вариантах реализации гидрофобную хроматографию проводят при добавлении сульфата аммония в количестве 35% от насыщения.
Преимущественно гидрофобную хроматографию проводят на фенилсефарозе с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ>1,5, а гельфильтрацию осуществляют на Toyopearl HW55F с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ>2,7.
Разработанный способ включает следующую совокупность признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) гомогенизация растительной ткани;
2) в качестве растительной ткани могут использовать как корни хрена, так и отходы, полученные при зачистке корней хрена при изготовлении пищевой продукции;
3) экстракция фермента;
4) концентрирование экстракта ультрафильтрацией;
5) очистка фермента гидрофобной хроматографией;
6) дополнительная очистка гель-фильтрацией;
7) лиофилизация фермента.
Достижение технического результата при использовании предлагаемого способа объясняется следующим образом.
Экспериментально было установлено, что образование полифенольных пигментов при разрушении биомассы является следствием протекания оксидазной реакции, которая приводит к частичной инактивации пероксидазы. Продувка буфера для экстракции азотом в течение 2 часов обеспечивает снижение концентрации кислорода до 25-30 мкМ и ингибирует образование полифенолов в 10-12 раз. Включение в состав гемина и хлорида кальция приводит к 100% насыщению активного центра гемином и дополнительной стабилизации фермента. Авторами изобретения предложено впервые использовать указанные добавки для изготовления пероксидазы, что позволило снизить расход корней хрена и повысить выход пероксидазы на единицу массы корней при высокой степени ее чистоты и активности.
Ускорение процесса получения пероксидазы достигается за счет введения стадии гидрофобной хроматографии, которая позволяет избавиться от дорогостоящего и трудоемкого осаждения сульфатом аммония. При этом достигается экономия сульфата аммония.
По сравнению с ближайшим аналогом отличительными признаками изобретения являются:
1) использование добавок гемина, хлорида кальция и предварительная продувка экстрагирующего буфера азотом при экстракции фермента;
2) очистка и одновременное концентрирование фермента гидрофобной хроматографией;
3) дополнительная очистка гель-фильтрацией в присутствии добавок гемина и кальция.
В дальнейшем способ будет иллюстрирован примером реализации.
3 кг промытых водой корней хрена измельчают в гомогенизаторе и заливают 3 л 0.1 М буферного раствора фосфата натрия, рН 7.0, в присутствии 5 мкМ раствора гемина и 5 мМ хлористого кальция, причем буферный раствор предварительно продут азотом. Экстрагирование ведут в течение часа. Экстракт отделяют декантацией, выдерживают сутки при 4°С и фильтруют через бумажный фильтр, а затем через ультрафильтры с диаметром пор 0.23 микрона для полного удаления остатков частиц биомассы перед стадией концентрирования. Концентрирование ведут ультрафильтрацией на проточной концентрационной ячейке с фильтром, удерживающим 30 кДа в течение 6 часов. Конечный объем составляет 0.5 л. Далее к раствору фермента добавляют 200 г сульфата аммония (35% от насыщения), выдерживают 3 часа при 4°С, отделяют выпавший осадок центрифугированием при 9000g, а супернатант наносят на колонку с фенилсефарозой, промывают 1 л буферного раствора, содержащего сульфат аммония, и снимают фермент градиентом сульфата аммония (35-0%) с одновременным повышением рН до 8.0. Собирают фракции с величиной параметра RZ>1,5; объем фракции составляет 100 мл.
Фермент дополнительно очищают гель-фильтрацией на 2 л колонке с Toyopearl HW55F, уравновешенной 0.1 М К-фосфатным буфером, рН 7.8, в присутствии 5 мкМ гемина и 5 мМ хлорида кальция. Собирают фракции основного пика (хвостовые фракции могут быть использованы для получения препаратов кислой изоформы пероксидазы хрена) с величиной параметра RZ>2,7; объем фракций составляет 150 мл. Фракции подвергают диализу против 2 л 5 мМ раствора того же буфера, сменяя буферный раствор 4 раза, и лиофильно высушивают. Высушенная пероксидаза имеет вид аморфной массы ярко-коричневого цвета, легко растворяется в водных буферных растворах. Выход фермента составляет 500 мг. Степень чистоты полученного фермента контролируют спектрофотометрически по показателю RZ (отношению величин поглощения на длинах волн 403 и 278 нм), величина которого должна быть не менее 2,7. Ферментативную активность пероксидазы определяют по индикаторной реакции с АБТС. Препарат считают кондиционным, если в 1 мг содержится не менее 1000 единиц активности. Массовую долю влаги определяют по ГОСТ 24061-89.
Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют, что реализации разработанного способа позволяет обеспечить достижение технического результата - снижение расхода корней хрена и повышение выхода пероксидазы высокой степени чистоты и активности, а также ускорение способа.
Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют, что реализация разработанного способа позволяет обеспечить достижение технического результата - снижение расхода корней хрена и повышение выхода пероксидазы высокой степени чистоты и активности, а также ускорение способа.
1. Способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию растительной ткани корней хрена, экстракцию фермента, отделение экстракта с последующим концентрированием ультрафильтрацией и гельфильтрацией и лиофилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что между стадиями ультрафильтрации и гельфильтрации фермент очищают гидрофобной хроматографией, причем экстрагирующий буфер предварительно насыщают азотом путем продувки и вносят гемин и хлорид кальция.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию фермента производят в 0,1 М буферном растворе фосфата натрия или калия в течение 1 ч при продолжающейся продувке азотом.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что гемин вносят в экстракт до концентрации 5 мкМ.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что хлорид кальция вносят в экстракт до концентрации 5 мМ.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидрофобную хроматографию проводят при добавлении сульфата аммония 35% от насыщения.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидрофобную хроматографию проводят на фенилсефарозе с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ>1,5.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что гельфильтрацию осуществляют на Toyopearl HW55F с последующим отбором фракций с величиной параметра RZ>2,7.
Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, а именно к микробиологическому получению ферментных препаратов - лакказ, и может быть использовано при модификации лигниносодержащих материалов и получении из них промышленно ценных соединений, отбеливании бумажной массы и текстильных материалов, очистке сточных вод и почвы от целого ряда ксенобиотиков, полимеризации фенолов и ряда других ароматических соединений, получении косметических препаратов для отбеливания кожи и окрашивания волос.
Изобретение относится к области производства гетерогенных катализаторов процессов жидкофазного окисления органических соединений - фенолов, поверхностно-активных веществ - перекисью водорода и может быть применено для каталитической очистки сточных вод от фенольных соединений.
Изобретение относится к биохимии, а именно к способам гидролитического расщепления нативного комплекса фермент пероксидаза+фенолы (хиноны), которые могут найти применение при изучении различных метаболических процессов, связанных с действием пероксидазы процессы лигнификации тканей, защитные реакции организмов, иммунологические исследования, при которых используется пероксидаза.
Изобретение относится к области биохимии. Используют липосомы в качестве матрицы для активированного фермента - пероксидазы хрена. К 5 мг окисленной перйодатным методом пероксидазы хрена добавляют 1 мл суспензии липосом в 0,01 М растворе карбонатно-бикарбонатного буфера при рН 9,5. Подвергают ультразвуковой обработке в течение 1 мин. Инкубируют 1 ч. Иммобилизуют с иммуноглобулинами в концентрации 5 мг в течение 2 ч при температуре 22±4°С. Стабилизируют 5 мг боргидрида натрия с последующей гель-хроматографической очисткой. Изобретение позволяет получить липосомально-иммунопероксидазный конъюгат для индикации возбудителей инфекционных заболеваний в иммуноферментном анализе и увеличить срок годности препарата до 6 лет. 1 табл., 3 пр.
Изобретение относится к новому способу получения флуоресцирующих катехоламинов, выбранных из допамина и адреналина, и их метаболитов, выбранных из гомованилиновой и ванилилминдальной кислот, методом дериватизации. Соединения могут быть использованы в качестве высокочувствительных и селективных маркеров для определения различный заболеваний. Способ дериватизации включает окисление исходных соединений и их взаимодействие с образующими конденсированные структуры аминами в среде CAPS-буферного раствора или глицин - КОН 0.1 мМ пероксидом водорода в присутствии в качестве катализатора пероксидазы хрена. Предпочтительно процесс проводят в 0,1 М буферном растворе при концентрации пероксидазы хрена 0,01-1 мкМ; концентрации пероксида водорода - 100 мкМ, концентрации амина - 0,1-33 мМ; концентрации катехоламинов и метаболитов - 0,03-1 мкМ. Способ является простым и технологичным, т.к. не требует повышенной температуры и осуществляется в водном растворе. 1 з.п.ф-лы, 2 ил., 3 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой применение оксидоредуктазы перекиси водорода для получения фармацевтической композиции для улучшения качества спермы или лечения мужского бесплодия, где оксидоредуктаза перекиси водорода представляет собой белок PRDX2. Изобретение относится также к композиции для улучшения качества спермы или лечения мужского бесплодия, содержащей белок PRDX2 и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение позволяет эффективно улучшить качество спермы или эффетивно лечить мужское бесплодие пациента, страдающего от астеноспермии. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 10 пр.
Изобретение относится к химической промышленности, а именно к области производства гетерогенных катализаторов процессов жидкофазного окисления органических соединений (в том числе, производных фенолов) и может быть применено на предприятиях различных отраслей промышленности для проведения реакций окисления, а также для каталитической очистки сточных вод от токсичных органических контаминантов. Гетерогенный катализатор жидкофазного окисления органических соединений содержит носитель, глутаровый диальдегид в качестве сшивающего агента и экстракт корня хрена (Armoracia Rusticana) в качестве активного компонента. Согласно изобретению в качестве носителя используют диоксид титана, модифицированный последовательно 0,095÷0,105 н. раствором соляной кислоты, 0,195÷0,205%-ным раствором хитозана в 0,0045÷0,0055 М растворе соляной кислоты и 4,95÷5,05%-ным раствором аминопропилтриэтоксисилана в 95,5÷96,5%-ном этаноле при следующем соотношении компонентов, % масс.: диоксид титана - 45÷55; хитозан - 7,5÷12,5; аминопропилтриэтоксисилан - 17,5÷22,5; сшивающий агент (глутаровый диальдегид) - 7,5÷12,5; активный компонент (экстракт корня хрена) - 7,5÷12,5. Технический результат - повышение активности, селективности и операционной стабильности гетерогенного катализатора в реакции жидкофазного окисления органических соединений перекисью водорода. 6 ил., 19 пр.
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства пероксидазы высокого качества из корней хрена для диагностических целей
Коммерчески доступные субстраты пероксидазы хрена 3,3’,5,5’-Тетраметилбензидин (англ. TMB ) и 3,3"-Диаминобензидин (англ. DAB ) при окислении дают цветные продукты, а хемилюминесцентные вещества SuperSignal, ECL являются источниками детектируемого света при действии HRP.
Усиление хемилюминесценции (ECL)
Пероксидаза хрена катализирует окисление люминола в 3-аминофталат через серию интермедиатов . Данная реакция сопровождается свечением низкой интенсивности с длиной волны 428 нм. В присутствии некоторых веществ, возможно достичь усиления свечения до тысячи раз. Явление усиления свечения называют усилением хемилюминесценции (англ. enhanced chemiluminescence, ECL ). Наиболее эффективными усилителями являются производные фенолов, например, п-йодфенол. ECL позволяет детектировать около 0,5 пикограмма нуклеиновой кислоты при Саузерн блоттинге .
Напишите отзыв о статье "Пероксидаза хрена"
Примечания
Внешние ссылки
- MeSH Horseradish+peroxidase
Отрывок, характеризующий Пероксидаза хрена
Посидев несколько времени и дотронувшись, сам не зная для чего, рукой до шероховатости блика портрета, он встал и опять позвал Боссе и дежурного. Он приказал вынести портрет перед палатку, с тем, чтобы не лишить старую гвардию, стоявшую около его палатки, счастья видеть римского короля, сына и наследника их обожаемого государя.Как он и ожидал, в то время как он завтракал с господином Боссе, удостоившимся этой чести, перед палаткой слышались восторженные клики сбежавшихся к портрету офицеров и солдат старой гвардии.
– Vive l"Empereur! Vive le Roi de Rome! Vive l"Empereur! [Да здравствует император! Да здравствует римский король!] – слышались восторженные голоса.
После завтрака Наполеон, в присутствии Боссе, продиктовал свой приказ по армии.
– Courte et energique! [Короткий и энергический!] – проговорил Наполеон, когда он прочел сам сразу без поправок написанную прокламацию. В приказе было:
«Воины! Вот сражение, которого вы столько желали. Победа зависит от вас. Она необходима для нас; она доставит нам все нужное: удобные квартиры и скорое возвращение в отечество. Действуйте так, как вы действовали при Аустерлице, Фридланде, Витебске и Смоленске. Пусть позднейшее потомство с гордостью вспомнит о ваших подвигах в сей день. Да скажут о каждом из вас: он был в великой битве под Москвою!»
– De la Moskowa! [Под Москвою!] – повторил Наполеон, и, пригласив к своей прогулке господина Боссе, любившего путешествовать, он вышел из палатки к оседланным лошадям.
– Votre Majeste a trop de bonte, [Вы слишком добры, ваше величество,] – сказал Боссе на приглашение сопутствовать императору: ему хотелось спать и он не умел и боялся ездить верхом.
Но Наполеон кивнул головой путешественнику, и Боссе должен был ехать. Когда Наполеон вышел из палатки, крики гвардейцев пред портретом его сына еще более усилились. Наполеон нахмурился.
– Снимите его, – сказал он, грациозно величественным жестом указывая на портрет. – Ему еще рано видеть поле сражения.
Боссе, закрыв глаза и склонив голову, глубоко вздохнул, этим жестом показывая, как он умел ценить и понимать слова императора.
Весь этот день 25 августа, как говорят его историки, Наполеон провел на коне, осматривая местность, обсуживая планы, представляемые ему его маршалами, и отдавая лично приказания своим генералам.
Первоначальная линия расположения русских войск по Ко лоче была переломлена, и часть этой линии, именно левый фланг русских, вследствие взятия Шевардинского редута 24 го числа, была отнесена назад. Эта часть линии была не укреплена, не защищена более рекою, и перед нею одною было более открытое и ровное место. Очевидно было для всякого военного и невоенного, что эту часть линии и должно было атаковать французам. Казалось, что для этого не нужно было много соображений, не нужно было такой заботливости и хлопотливости императора и его маршалов и вовсе не нужно той особенной высшей способности, называемой гениальностью, которую так любят приписывать Наполеону; но историки, впоследствии описывавшие это событие, и люди, тогда окружавшие Наполеона, и он сам думали иначе.
Наполеон ездил по полю, глубокомысленно вглядывался в местность, сам с собой одобрительно или недоверчиво качал головой и, не сообщая окружавшим его генералам того глубокомысленного хода, который руководил его решеньями, передавал им только окончательные выводы в форме приказаний. Выслушав предложение Даву, называемого герцогом Экмюльским, о том, чтобы обойти левый фланг русских, Наполеон сказал, что этого не нужно делать, не объясняя, почему это было не нужно. На предложение же генерала Компана (который должен был атаковать флеши), провести свою дивизию лесом, Наполеон изъявил свое согласие, несмотря на то, что так называемый герцог Эльхингенский, то есть Ней, позволил себе заметить, что движение по лесу опасно и может расстроить дивизию.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения пероксидазы хрена включает гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией и осаждение белков сульфатом аммония. Осадок белков диализуют против воды и 0,01-0,03 М раствора TEA-HCl буфера, с последующей очисткой пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере. Затем продолжают очистку в 0,01-0,03 М растворе МОРS-NаОН буфера на колонке с КМ-целлюлозой при значениях pH и pK буферов 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно. Очищенный целевой продукт диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl, а затем лиофилизируют. Способ обеспечивает упрощение получения высокоочищенной пероксидазы хрена и повышение ее выхода. 2 з.п. ф-лы.
Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, а именно к получению высокоочищенной пероксидазы хрена адсорбционной хроматографией.
Высокоочищенная пероксидаза хрена (критерий очистки А 403 /А 275 3,1 - RZ от Reinheitszahl - показатель чистоты) - один из наиболее востребованных ферментов для биохимии и биотехнологии. В частности, она широко используется в методах иммуноферментного анализа, например, для определения ВИЧ-инфекции, гепатитов и других социально значимых заболеваний человека.
Известен способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента водой или солевым раствором, фракционирование экстракта сульфатом аммония, очистку гель-фильтрацией, спиртовым осаждением, переосаждением хлоридом аммония, фильтрацией через сефадекс G-50, ионообменной хроматографией и диализом .
Недостатками этого способа являются сложность и продолжительность получения, сравнительно низкая чистота полученного препарата (RZ~2,7), трудность получения большого количества фермента.
Известен также способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, фракционирование экстракта сульфатом аммония, гель-фильтрацию .
Недостаток этого способа заключается в низком выходе фермента, низкой его чистоте.
Задачей данного изобретения является повышение выхода высокоочищенного фермента при упрощении способа производства.
Поставленная задача решается тем, что предложен способ получения пероксидазы хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией, осаждение белков сульфатом аммония, диализ осадка белков против 0,01-0,03 М раствора TEA (триэтаноламин)-HCl буфера, последовательную очистку пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере, а затем в 0,01-0,03 М растворе MOPS(N-морфолинопропансульфоновая кислота)-NaOH буфера на колонке с КМ-целлюлозой, при значениях pH и pK буферов, близких к изоточке целевого продукта, и концентрации, обеспечивающей движение пероксидазы вниз по колонке, по принципу адсорбции-десорбции, со скоростью, меньшей, чем у части балластных белков, имеющих одноименный заряд с зарядом на колонке, тогда как другая их часть остается на старте вследствие ионного обмена; раствор очищенного целевого продукта диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl с последующей лиофилизацией, причем фермент после гомогенизации корней экстрагируют водой, сульфат аммония вносят в концентрации 70-75% от насыщения, а значения pH и pK буферов составляют 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно.
Отличием данного способа является одновременное использование одного и того же носителя для адсорбционной хроматографии целевого продукта и для очистки от балластных белков, при значениях pH, близких к изоточке целевого продукта, а также использование буферов небольшой концентрации со значениями pK, близкими к изоточке фермента, причем компоненты буферов имеют объемистые электронодонорные или электроноакцепторные группы, конкурирующие за адсорбент с группами макромолекулы пероксидазы. Пероксидазу хрена получают из сока корней хрена, собранных в самом начале цветения, в это время содержание фермента в корнях в 3-4 раза выше, по сравнению с прототипом.
Техническим результатом решения задачи является получение пероксидазы с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента (субстрат 4-аминоантипирин) за одну стадию. Выход фермента 3,2 г из 100 кг корней, что в 6 раз выше по сравнению с прототипом. Предложенный способ позволяет уменьшить число стадий и за счет этого снизить время на получение целевого продукта и увеличить в 1,5-2 раза его выход.
Известно, что адсорбция белков на каком-либо сорбенте связана с различными нековалентными взаимодействиями макромолекулярных групп с поверхностью этого сорбента. Однако их суммарная энергия мала по сравнению, например, со связыванием белок-ингибитор при аффинной хроматографии или ионными взаимодействиями на ионообменнике. Таким образом, адсорбционное взаимодействие маскируется другими, более сильными взаимодействиями поверхность белка-поверхность носителя. Поэтому, если предполагается очистить данный белок адсорбционной хроматографией, необходимо создать такие условия, чтобы балластные белки либо связывались на колонке, либо двигались по ней быстрее целевого белка, т.е. чтобы только данный белок мог медленно двигаться по принципу адсорбции-десорбции. Такие условия создаются, если использовать в качестве носителя для адсорбционной хроматографии целлюлозу, а для очистки от балластных белков использовать ДЭАЭ- и КМ-группы. Для того чтобы добиться одновременного движения целевого фермента по принципу адсорбционной хроматографии, а части балластных белков - вследствие отталкивания заряженного белка от одноименно заряженных групп, необходимо совместить эти группы и целлюлозный носитель, т.е. использовать ДЭАЭ- и КМ-целлюлозы. Если проводить хроматографию при значениях pH, близких к изоточке целевого фермента, часть балластных белков задерживается на старте вследствие ионного обмена, а часть быстро движется вниз из-за взаимодействия с одноименными зарядами ионообменника. Незаряженный или слабо заряженный фермент будет медленно двигаться, по сравнению с балластными белками, вниз и на ДЭАЭ- и на КМ-целлюлозах в случае конкуренции между группами фермента и компонентами буфера за сорбент.
Буфер имеет:
1) небольшую концентрацию, поскольку при ее повышении конкуренция компонентов буфера может быть столь сильной, что целевой продукт будет двигаться со скоростью, сравнимой со скоростью движения балластных белков, и очистки не произойдет;
2) поскольку буфер должен обеспечить устойчивое значение pH при небольшой концентрации, он должен иметь pK, близкое к изоточке целевого продукта;
3) компоненты буфера должны иметь объемистые группы для эффективной конкуренции с поверхностными группами целевого продукта. Балластные белки будут заряжены при этом значении pH и, в зависимости от заряда, либо остаются на старте («ионный обмен»), либо движутся значительно быстрее целевого продукта (взаимодействие одноименных зарядов). Незаряженный или слабо заряженный целевой продукт будет отделяться и от белков, остающихся на старте, и от быстро движущихся белков. Лишь белки, имеющие изоточки, близкие к изоточке пероксидазы, могли бы связываться адсорбционно и тем самым уменьшать степень очистки, но, как показывает опыт, такие белки в соке из корней хрена отсутствуют или находятся в минорном количестве.
Очистка целевого продукта:
1) белки из сока корней хрена после их гомогенизации экстрагируют водой, доводят ультрафильтрацией до начального объема сока, осаждают сульфатом аммония, диализуют против воды, а затем против 0,01-0,03 М ТЕА-HCl буфера, pH 7,1-7,4 и наносят последовательно на колонки с ДЭАЭ-целлюлозой в Cl - -форме и КМ-целлюлозой в Na + -форме, уравновешенные соответственно 0,01-0,03 М ТЕА-HCl и 0,01-0,03 М MOPS-NaOH буферами, pH 7,1-7,4 (pK буферов 7,5 и 7,6; изоточка пероксидазы 7,2);
2) за медленным движением коричневого кольца фермента следят визуально;
3) после выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,01-0,03 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,01-0,03 М NaCl и лиофилизируют;
4) измеряют значения RZ продукта и его активность по 4-аминоантипирину.
Для измерения пероксидазной активности в кювету вносят 1,5 мл фенол-аминоантипиринового раствора (810 мг фенола растворяют в 40 мл воды, добавляют 25 мг 4-аминоантипирина и разбавляют водой до 50 мл), 1,4 мл раствора пероксида водорода (1 мл 30% H 2 O 2 разбавляют водой до 100 мл; далее 1 мл этого раствора разбавляют 0,2 М калий-фосфатным буфером, pH 7,0 до 50 мл), 0,1 мл раствора фермента. Измерение оптической плотности проводят при 510 нм и температуре 25°С. Определяют скорость из линейной части кривой:
ед/мг=( А 510 /мин)/6,58×мг фермента/мл.
Концентрация фермента равна: мг фермента/мл=А 403 ×0,44.
Следующие примеры иллюстрируют эти положения.
Пример 1. 100 кг корней хрена двухлетнего возраста, собранных в начале цветения, промывают водой, гомогенизируют, экстрагируют фермент водой, концентрируют ультрафильтрацией до начального объема сока, осаждают белок сульфатом аммония (70% насыщения). Осадок растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против нее, а затем против 0,01 М ТЕА-HCl буфера, pH 7,1. Концентрацию белка доводят до 80 мг/мл концентрированием ультрафильтрацией (определение белка по Бредфорд или Лоури) и наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,01 М ТЕА-HCl буфером, pH 7,1 и pK 7,5. После прохождения самотеком коричневого кольца его наносят на колонку того же объема с КМ-целлюлозой, уравновешенную 0,01 М MOPS-NaOH буфером, pH 7,1 и pK 7,5. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,01 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,01 М NaCl и лиофилизируют.
Пример 2. 100 кг корней хрена двухлетнего возраста, собранных в начале цветения, промывают водой, гомогенизируют, экстрагируют фермент водой, концентрируют ультрафильтрацией до начального объема сока, осаждают белок сульфатом аммония (75% насыщения). Осадок растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против нее, а затем против 0,03 М ТЕА-HCl буфера, pH 7,4. Концентрацию белка доводят до 80 мг/мл концентрированием ультрафильтрацией и наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,03 М ТЕА-HCl буфером, pH 7,4, pK 7,6. Далее хроматографируют целевой продукт, как в примере 1, на КМ-целлюлозе, но в 0,03 М MOPS-NaOH буфере, pH 7,4, pK 7,6. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,03 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,03 М NaCl и лиофилизируют.
Выход: 3,2 г пероксидазы с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента по 4-аминоантипирину.
Пример 3. 15 г лиофилизированного порошка пероксидазы с RZ 0,3 суспендируют в 0,01 М TEA-HCl буфере, pH 7,1 центрифугируют (20 мин, 3000 г) и 300 мл супернатанта наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную тем же буфером. После прохождения самотеком коричневого кольца его наносят на колонку того же объема с КМ-целлюлозой, уравновешенную 0,01 М MOPS-NaOH буфером, pH 7,1, pK 7,5. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,01 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,01 М NaCl и лиофилизируют.
Пример 4. 15 г лиофилизированного порошка пероксидазы с RZ 0,3 суспендируют в 0,03 М TEA-HCl буфере, pH 7,4, центрифугируют (20 мин, 3000 г) и 300 мл супернатанта наносят на колонку (10×20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную тем же буфером. После прохождения самотеком коричневого кольца его наносят на колонку того же объема с КМ-целлюлозой, уравновешенную 0,03 М MOPS-NaOH буфером, pH 7,4, pK 7,6. После выхода фермента из колонки с КМ-целлюлозой его диализуют последовательно против воды и 0,03 М NaCl, разбавляют до 2-5 мг/мл раствором 0,03 М NaCl и лиофилизируют.
Выход составляет 1,5 г целевого продукта с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента по 4-аминоантипирину.
Таким образом, предлагаемый способ в сравнении с прототипом позволяет получить целевой продукт с RZ 3,35 и активностью 1000 ед/мг фермента по 4-аминоантипирину. Выход фермента составляет 3,2 г на на 100 кг корней, что превышает выход по прототипу ~ в 6 раз. Кроме того, полученный целевой продукт обладает большей чистотой по сравнению с прототипом (RZ соответственно 3,35 и 2,7). Упрощение способа выражается в сокращении биохимических стадий с четырех до одной. Этот способ позволяет также выделять высокоочищенную пероксидазу из лиофильно высушенного низкоочищенного фермента.
Источники литературы
1. Paul К.G. The Enzymes. New York, Acad. Press, 1963.
2. Патент РФ № 2130070.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения пероксидазы хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией, осаждение белков сульфатом аммония, диализ осадка, отличающийся тем, что осадок белков диализуют против воды и 0,01-0,03 М раствора TEA-HCl буфера с последующей очисткой пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере, а затем в 0,01-0,03 М растворе MOPS-NaOH буфера на колонке с КМ-целлюлозой, при значениях pH и pK буферов, близких к изоточке целевого продукта 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно, очищенный целевой продукт диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl, а затем лиофилизируют.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент после гомогенизации корней экстрагируют водой.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что сульфат аммония вносят в концентрации 70-75% насыщения.
